In-Fusion®クローニング
SnapGeneは各種クローニング法をシミュレーションすることが可能です。このチュートリアルでは In-Fusion®クローニングのシミュレーションをご紹介します。
1. 【準備】配列を入手する
今回は、pCDNA3.1に Luciferase 遺伝子をクローニングするというシミュレーションを行います。使用するデータを下記よりダウンロードしSnapGeneで読み込み保存します。ファイルの読み込みはSnapGene基本操作:3.ファイルを読み込むを参照して下さい。
Mammalian expression vector with a CMV promoter for expressing C-terminally Myc-tagged proteins.
www.snapgene.com
ルシフェラーゼ遺伝子の配列は、pGL3-Promoter を使います。
SV40 promoter-containing vector for measuring the activity of enhancer sequences with a luciferase assay.
www.snapgene.com
2. In-Fusion®クローニング
ツールバーにある「アクション」から「In-Fusion®クローニング」を選択して、「断片を挿入」をクリックしてください。
「ベクター」タブで置換したい部分を選択し、「断片」タブで挿入したい部分をクリックします。ここでは、MCS(895 - 985 bp) と Myc (986-1015 bp) の塩基配列を選択します。
「断片」タブを選択し、右側の「断片のソース」のドロップダウンリストから pGL3-Promoter.dna を選択し、マップ上で挿入したい部分をクリックします。ここでは Luciferase (895 - 2547 bp) を選択します*。
「産物」タブを選択し、右側の「オーバーラップしているPCRプライマーを選択」をクリックします。
Tm値やオーバーラップする塩基数を設定して「プライマーを選択します」をクリックします。
シークエンスビューでクローニング後の配列を確認したり、プライマービューで実際に使用するプライマーの配列を確認しすることができます。
シークエンス、プライマーに問題がなければ、右下の「産物作成」に任意のファイル名(今回は “pCDNA3.1-Luc” )を入力し、「クローン」ボタンをクリックします。
pCDNA3.1-Luc.dna ファイルが作成され、In-Fusion® クローニングを用いたプラスミドマップがマップビューに表示されます。
マップビューおよびシークエンスビューで、 pcDNA3.1+/C-Myc(MCS)に Luciferase遺伝子 がクローニングされていることを確認できます。
履歴ビューからは、In-Fusion®クローニングの過程を、マップ形式/テキスト形式で確認できます。
新たに作成したプラスミドマップは保存されていませんので、任意のフォルダの保存するのを忘れないようにしてください。
チュートリアルで紹介した機能や操作方法に関するお問い合わせはお問合せフォームよりお願いします。